A imuno-histoquímica é uma técnica histológica usada para revelar a presença de determinadas proteínas nos tecidos. Baseada na relação antígeno-anticorpo, é hoje em dia amplamente empregada na pesquisa básica e em realização de exames patológicos. Diferente da imuno-fluorescência, esta técnica preserva aspectos morfológicos dos tecidos, permitindo que se façam correlações quantitativas entre diferentes estruturas.

A observação dos tecidos é feita por microscopia de campo claro, e a captura de imagens para análise requer normalmente apenas uma câmera com boa resolução.

A observação da técnica de amostragem dos tecidos é fundamental. Transformar um conjunto de imagens em números comparáveis é apenas uma parte da análise. É necessário que estes valores sejam representativos do que se quer analisar, para que a análise se transforme em informação passível de comprovar hipóteses. Dentre as várias considerações a serem feitas a este respeito, destaco a distribuição randômica das estruturas a serem analisadas nas imagens. A representação das estruturas deve ser conformada de modo que a chance de uma estrutura marcada aparecer na imagem seja igual em todo o campo. Com isto podemos representar a quantidade de proteína marcada por percentuais de área ocupada por marcação nos campos observados, o que nos isenta de atribuir calibrações espaciais nas imagens.

Outro aspecto importante a ser observado é a coloração do tecido. A revelação da proteína por DAB é muito usada. A técnica envolve uma etapa de banho onde a cor castanho revela os locais de ocorrência da proteína no tecido. A não observância do tempo de duração do banho ou da concentração dos reagentes pode provocar uma falta de uniformidade de marcação capaz de inviabilizar a comparação entre diferentes amostras, e consequentemente mascarar ou produzir resultados inesperados.

A quantidade de casos a serem estudados e sua representação nos grupos a serem comparados também é fundamental. A maioria dos testes estatísticos pressupõem uma distribuição normal dos dados para serem aplicados, o que se consegue a partir de cinco casos por grupo pelo menos. Existem formulas para se calcular o tamanho amostral para o estudo de um fenômeno.

A análise morfológica neste contexto passa a ser o menor dos problemas. Uso uma técnica semi-automática que cumpre os seguintes passos,

1 – abro uma imagem contida em um diretório.

2 – faço uma segmentação de cores por amostragem, contrastando o que é marcação do que não é marcação.

3 – quantifico a área ocupada por marcação em relação à área total da imagem.

4 – salvo os resultados em uma planilha eletrônica, para posterior formatação e análise estatística.

Protótipo de análise de glomérulos imunomarcados com DAB, feito com o Image Pro Plus (Media Cybernetics)